Бесцветная жидкость с приятным запахом. Органические химические соединения примечания

М ногие, наверняка знают, как легко и просто реплицировать часть собственной ДНК. Процесс нехитрый по сути. Зато сколько потом восторженных сюсюканий из серии “ах, как он/она похож(а) на папу/маму!”. Однако, задача сильно усложняется, когда нужно создать некую абстрактную модель ДНК у себя на столе из подручных материалов.

Нафига это мне понадобилось, спросите? Очень просто. У дочери в школе есть предмет аналогичный “биологии” в российских школах. Соответственно, ученикам задали домашний проект, который включает в себя не только получение теоретических знаний о строении ДНК, но и создание модели оной. C этой моделью потом нужно выступать перед учителем и классом, рассказывая, что там в ней и как.

Вообще, это будет не совсем “мой” пост. Он, скорее посвящен дочери. Хотя я и принимал некоторое участие в процессе, в основном это участие сводилось к консалтингу… Однако, вдруг кому будет интересно или, вдруг у кого ребенку в школе зададут сделать аналогичную шнягу. Вот и руководство готовое получится.

Согласно условиям задачи, модель должна удовлетворять определенным требованиям. Интересно, что ученик сам может выбрать, какие условия он выполнит. Каждый пункт презентации “весит” определенное количество зачетных баллов. Соответственно, можно пойти по простому пути и набрать некий минимальный проходной балл или попробовать реализовать “программу максимум”.

Исходная постановка задачи:

Так же, как следует из задачи, это не обязательно должна быть именно модель. Это может быть что угодно – от книжки с рассказом до пазла. Главное, чтобы это имело некое физическое представление. Отдельно отмечено, что, если ученик решит делать именно модель, то запрещается использовать готовый магазинный набор. Типа такого , например.

Дочь решила делать модель и постараться настрелять максимальное число баллов. ОК.

Начали с компьютерной модели… Я на самом деле – не настоящий сварщик. Ну, т.е., в общих чертах знаю, что такое ДНК, из чего она состоит и как её принято изображать. Не более того. Поэтому уже с самых первых шагов, инициативу перехватила дочь. Она смогла растолковать мне что из чего состоит и что к чему прикрепляется.

Вышло что-то вроде такого:

Когда стало понятно. какие запчасти нам понадобятся, отправились по магазинам.Понадобится: пенопластовые шарики двух размеров, деревянные прутки, краска, клей и кусочек MDF для подставки.

Ах, да… Еще обязательно понадобится Пес:

Если честно, я сам не очень понимаю за каким хреном нужен Пес, но зато у него самого уверенности в этом хватило на нас всех. На самом деле, он только мешался… Но может быть я просто что-то недопонял.

Пенопластовые шарики были куплены в “долларом” магазине. В разделе “все для вечеринок”. Даже не хочу пытаться понять, как в контексте вечеринки могут быть использованы пенопластовые шарики. Но хорошо, что они нашлись. Это был у нас самый проблематичный момент. Нужно было найти такие шарики, которые было бы легко обрабатывать. Например, стеклянные шарики не подойдут – запаришся сверлить. Деревянные… В принципе, подошли бы. Для меня. Но работать предстояло дочери и я сомневался, что она вот так сходу сможет ровно продырявить деревянный шарик ручной дрелью. Половину запорет с непривычки. А они достаточно дорогие. Нужен был более мягкий и дешевый материал. Пенопласт подошел просто идеально.

Деревянные рейки были куплены в магазине стройматериалов. Эти прутки – более тонкие собратья тех, что я использовал для декорирования кровати и тумбочек . С этим проблем не было. Они всегда есть в большом многообразии во всех строительных магазинах.

Краски/клей – тривиально. Взяли обычную краску в аэрозоле. Сперва попробовали на одном из шариков – краска пенопласт не съела. Соответственно купили нужное количество цветов. Клей – обычный ПВА.

Кусок MDF-панели для подставки у меня уже был в загашнике. Можно приступать к работе.

Сперва подставка. Дочь прислушалась к моему совету и распечатала на принтере шаблон, который приклеила на кусок MDF:

Её вариант был – найти блюдце подходящего диаметра и обрисовать по нему окружность. Но я смог её убедить, что такой путь – не путь самурая. Кому, как не мне знать, что у нас в хозяйстве нет блюдец подходящего диаметра с ровной кромкой – все с волнистым краем. Плавали уже – знаем:-)

На удивление ровно вырезала. Я даже прифигел слегка…

Незначительные неровности по краю она убрала на шлифмашинке:

Чтобы придать эстетизьму подставке, её кромка была обработана на фрезе:

Получился вот такой диск:

Ну и отверстие по центру, в которое будет вставлена модель:

Далее предстояла сама занудная операция. Нужно было взять пенопластовый шарик и просверлить в нем два сквозных отверстия крест накрест. Через первое отверстие такой шарик насаживается на общую ось, в другое отверстие, с обоих его концов втыкаются поперечные палочки. Таких шариков нужно было сделать десять штук:

Труднее всего было мне. Вы не представляете себе, какая это пытка – стоять и смотреть. Вместо того, чтобы самому схватить дремель и быстро насверлить все за пару минут. Дочь управилась где-то за пол часа… Неспешная методичность с которой она все это проделывала – просто убивала меня:-)

Полученный результат она назвала шашлыком:

Теперь в шашлык предстояло напихать поперечные палочки. Они были нарезаны все из того же деревянного прутка, что и центральная ось:

Опять же, она хотела резать палочки ножовкой, но мне удалось убедить её, что отрезной диск и дремель – гораздо быстрее.

Следующий этап: взять полученные палочки:

… и напихать их в полученный ранее шашлык:

Это нужно было для того, чтобы приклеить центральные шарики (кстати, это вам не фигня какая, а самые настоящие водородные связи) с общей палке. На фото можно увидеть, что к основанию прицеплен очередной шаблон на котором размечены сегменты. Поперечины втыкаются в шарик, на центральную ось наносится клей, шарик выставляется на нужной высоте и поворачивается вдоль нужного сектора разметки. Т.е. на данном этапе, поперечины помогают позиционировать центральный шарик с нужным углом поворота. Повторить десять раз:

После этого, поперечины можно вынуть и отправить запчасти в покраску:

Как все высохло, приступили к финишной сборке.

На каждую поперечную палочку прицеплялась деоксирибоза… Кажется… Deoxyribose в оригинале. Пес его знает, что это… Не важно. Главное, что дочь знает, что это. Ей перед учителем презентуху толкать, а не мне:-)

Сами эти шарики должны быть белыми, поэтому красить их не пришлось:

Долгий и кропотливый процесс сборки модели:

Осталось добавить только фосфатные цепочки (phosphates). Насколько мы поняли, их и принято изображать в виде той самой, узнаваемой двойной спирали.

Из плотной толстой бумаги серебристого цвета были выкроены две ленты:

Эти полоски клеятся к вершинам крайних шариков на модели. Вот так:

На этом этапе я впервые принял личное участие. Двух рук оказалось недостаточно. Надо, чтобы кто-то один держал и направлял полоски, а второй – мазал клеем и прижимал.

Худо-бедно мы с этой процедурой управились, получив в итоге, желаемую модель:

Согласно условиям задачи, нужно было так же, обозначить все запчасти. Решили ограничиться прилепливанием легенды к подставке. Как назло, кончились цветные чернила в принтере. Поэтому пришлось напечатать ч/б вариант и раскрасить его фломастерами:

Ламинация тоже не прошла с первого раза. Агрегат сжевал две этикетки, прежде чем нормально сделал третью:

Не знаю в чем дело было. Я уже сто раз пользовался этим агрегатом и ни разу до этого он ничего не жевал… Так или иначе, свою этикетку мы получили:

Модель готова:

Теперь дочери надо вызубрить устную часть презентации. Но с этим я уже помочь ей никак не могу. Надеюсь справится сама. Еще неделя у нее есть на зубрежку теоретической части. Напишу потом, как отсрелялась с проектом..

Всем привет, меня зовут Александр Соколов, и я хочу рассказать, как сделал дома секвенатор – прибор для расшифровки ДНК. Рыночная цена такого прибора составляет около 10 миллионов рублей.

Краткий экскурс в генетику. Если вдруг вы помните, в 2003 г. было сделано сенсационное заявление: ученые, наконец, расшифровали геном человека. Геном построен из ДНК, а ДНК – это исходный код организма. ДНК представляет собой двойную цепочку, состоящую из 4-х видов нуклеотидов, которые повторяются в геноме человека порядка 3 млрд. раз. Так же, как в битах зашифрована вся информация на вашем компьютере, в нуклеотидах зашифрована инструкция о сборке всех белков человеческого тела. То есть зная, в какой последовательности расположены нуклеотиды в ДНК, мы теоретически можем собрать все необходимые белки и получить модель человека. Так вот в стандартном понимании ученые не расшифровали ДНК, а просто перевели химическую последовательность в набор нулей и единиц на компьютере. Что делать с этим дальше – отдельный разговор. Например, на данный момент нам ясна функция лишь 5% всего массива генома (это кодирование белков). Чем занимаются остальные 95%, можно только предполагать.

В 2003 году стоимость секвенирования ДНК человека составляла около 100 млн долларов. С течением времени эта цифра уменьшалась и сейчас она приближается к тысяче долларов. Вы платите, вашу ДНК секвенируют и отдают вам жесткий диск с 3 ГБ информации – вашим геномом в цифровом виде.

Сегодня на рынке представлено три основных секвенатора. Самый производительный, Hiseq, и его приемник NovaSeq, обеспечивает самое дешевое (флуоресцентное) секвенирование. Один его запуск длится несколько дней, и за это время обрабатываются геномы сразу нескольких человек. Однако сам запуск стоит около десятка тысяч долларов. К слову, и сам прибор стоит порядка $1 млн, а, поскольку устаревает он примерно за 3 года, для того, чтобы он окупился, он должен приносить вам $1000 в день.

Второй прибор появился на рынке буквально прошлым летом. Он называется Nanopore и базируется на очень интересной технологии, когда ДНК секвенируется путем пропускания через нанопору. Самый дешевый вариант Nanopore позиционируется как одноразовый домашний секвенатор и стоит $1000.

Третий прибор – PGM, полупроводниковый секвенатор, который стоит $50 000 у себя на родине и около 10 млн рублей (с доставкой, растаможиванием и т. д.) в России. Процесс секвенирования на нем занимает порядка нескольких часов.

Что ж, десяти миллионов у меня не было, а PGM захотелось. Пришлось сделать самому. Сначала вкратце о том, как происходит полупроводниковое секвенирование. Вся цепочка ДНК делится на фрагменты длиной по 300-400 нуклеотидов, называемые ридами. Затем риды прикрепляются к маленьким сферам и многократно копируются – в итоге на каждой сфере «висит» целый пучок одинаковых фрагментов ДНК. Копирование нужно для усиления сигнала от каждого конкретного рида. Набор разных сфер называется библиотекой ДНК.

Сердцем PGM является одноразовый чип – матрица, похожая на матрицу в фотокамере, только вместо пикселей, реагирующих на свет, здесь pH-транзисторы, реагирующие на изменение кислотно-щелочного баланса. Полученная библиотека ДНК загружается на чип, содержащий 10 млн лунок, на дне каждой из них находится pH-транзистор. В лунку умещается только одна сфера и, следовательно, риды только одного типа (с одной определенной последовательностью нуклеотидов). Далее на чип подаются реагенты таким образом, чтобы ДНК начала себя копировать. А копируется она линейно, то есть нуклеотиды прикрепляются к вновь создаваемой цепочке в том порядке, в котором они стоят в материнской цепочке. Поэтому на чип подается один тип нуклеотидов – и тут же фиксируется изменение pH в некоторых лунках (это значит, что в них произошло присоединение данного нуклеотида). Далее подается другой тип нуклеотидов и фиксируется изменение pH в лунках и т. д. Таким образом, подавая на чип все 4 типа нуклеотидов много раз, мы можем получить информацию о последовательности нуклеотидов в каждом риде. Затем математическими способами прочитанные короткие отрезки собираются на компьютере в единую цепочку. Чтобы собрать ее более-менее уверенно, каждый рид нужно прочесть примерно по 100 раз.

Рис.1. Полупроводниковое секвенирование

Теперь разберемся, из чего состоит сам прибор. Имеется, как мы уже знаем, чип, а также система подачи реагентов и материнская плата. Все секвенирование ведется именно на чипе – остальной аппарат только передает на него определенные сигналы, подает реагенты, считывает с него аналоговые сигналы, оцифровывает их и гонит полученный поток информации на компьютер, где данные накапливаются и обрабатываются.

Рис. 2. Устройство секвенатора

Чип позиционируется как одноразовый и после использования выкидывается. Соответственно, там, где работает PGM, такие чипы можно достать бесплатно в любом количестве. Зачем их доставать, спросите вы? Дело в том, что чип мне уже удалось использовать многократно. По сути он вечен: достаточно хорошо промывать его – и можно применять вновь и вновь. По точности работы он ничем не будет отличаться от нового. Сама моя идея заключалась в том, чтобы сделать прибор под этот условно бесплатный чип.

Итак, передо мной встала задача реверс-инжиниринга чипа. Разумеется, никакой документации на заветную микросхему найти было нельзя – производитель не собирался делиться секретами производства, а хотел спокойно продавать свои приборы за $50 000. Для начала я сделал самое очевидное и простое: прозвонил контакты тестером. Стало ясно, где расположены цифровые и аналоговые входы-выходы, питание и прочее. Кое-какую информацию удалось почерпнуть из патентов на чип. Но всего этого, понятно, было недостаточно для создания полноценного продукта. Я еще повозился с чипом, проверял разные свои догадки, поэкспериментировал с подачей сигналов, но никуда принципиально не продвинулся. Пришлось поставить проект на паузу.

Рис. 3. Прозвонка чипа

А затем внезапно на Habrahabr мне попалась статья известного блоггера BarsMonster о том, как он делает реверс-инжиниринг чипов! Воодушевился, написал ему, написал другим энтузиастам, отправил запрос в Киев, где занимались фотографированием чипов. Из Киева ответили, что полировать по слоям они не умеют, могут только отснять верхний слой, а так как мой чип – многослойный, будет не понятно, куда идут дорожки от контактов. Потом познакомился с одним американцем, который тоже занимается реверс-инжинирингом чипов, послал ему свои микросхемы, но и тут дальше фотографирования верхнего слоя дело не пошло. Затем наткнулся в интернете на статью про тех, кто смог отреверсить чип Sony PlayStation и пр. («Слава героям!» и вот это все, если кто в курсе). Решил написать им с вопросами, нашел их ники – и тут же понял, что один из них мне знаком. Недавно товарищ свел меня со своим другом, который «тоже занимается генетикой на любительском уровне», мы пообщались с этим другом в Skype и на этом диалог закончили. И вот я понимаю, что мой новый приятель – мегакрутой мастер реверс-инжиниринга чипов. Тут же написал ему. Однако выяснилось, что, хоть помочь он и готов, у него нет микроскопа. Снова тупик.

А через несколько месяцев нужный микроскоп нашелся в соседней лаборатории! Правда, встроенная в него камера была ужасной, я фотографировал на мобильный телефон через окуляр и получал снимки вот такого качества:

Рис. 4. Чип под микроскопом

Затем на последний Новый год отличный микроскоп за 130 тыс. появился у меня на работе (я – специалист по квантовой криптографии). Мечты сбываются. Наконец, я смог нормально сфотографировать чип сверху.

Рис. 5. Мой рабочий микроскоп

А потом… Потом мне все-таки пришлось самому освоить технику его полировки. Трудность полировки заключается в том, чтобы снимать слои металла толщиной порядка 1 микрона – при этом ширина чипа составляет 1 сантиметр. Для сравнения скажу, что это примерно то же, что допустить на 1 км погрешность не более 10 см. Я очень старался. Результаты моих трудов представлены на следующем фото:

Рис. 6. Реверс-инжиниринг под оптическим микроскопом

Довольно хорошо видны нижний кремниевый слой, верхний слой с транзисторами, первый, второй, третий и четвертый слои металла.

Чип состоит из повторяющихся зон (типа сдвиговых регистров), и по таким картинкам было очень удобно его анализировать: сразу становилось ясно, что происходит на разных слоях. Я «отреверсил» самые «нафаршированные» участки с обилием логики, которые многократно повторялись. Но самым сложным оказалось отследить трассы, идущие по всему чипу, понять, какой внешний контакт к чему относится. С новогодних праздников до конца февраля, я, вооружившись новым прекрасным микроскопом, корпел над этой задачей – сидел на работе до десяти ночи, «реверсил», думал. И тут произошло новое чудо: товарищ смог организовать бесплатную фотосъемку чипа по слоям на электронном микроскопе в МИРЭА. «Фотосессия» крохи в 1 кв. см представляла собой 50 ГБ черно-белых фотографий.

Теперь все эти отдельные фотографии нужно было каким-то образом объединить в одну целую картинку. Чуть ли не в тот же день я написал на «питоне» программу, которая генерировала HTML-файл – при его открытии в браузере я получал требуемое. (Кстати, самая старая 10-я Opera справилась с этим лучше всего, рекомендую!) Затем на javascript написал еще одну программу, позволяющую сравнивать слои, плавно переходить между ними, выравнивать их, подбирать масштаб и т. д. Наконец, в моих руках были все инструменты для решения главных задач. Я отследил трассы, пронизывающие чип, и восстановил всю его структуру до последнего транзистора.

Еще одна фотография среза чипа, сделанная под рентгеном (в МИРЭА):

Рис. 7. Съемка под электронным микроскопом

Хорошо видны лунки, куда попадают сферы с ридами. Ниже располагаются три слоя металла, а еще ниже – слой с транзисторами.

Следующим этапом борьбы за светлое будущее стало создание под чип материнской платы. Спроектировал ее и отправил заказ на производство. А пока суд да дело использовал для работы с чипом плату «Марсоход-2» с FPGA. (FPGA – это, грубо говоря, массив из 10 000 универсальных логических элементов; программируя FPGA, мы можем получать любую логическую схему, легко обрабатывающую гигабитные потоки информации.) Прошивку для FPGA я написал сам, а кроме того, для динамического управления системой написал софт, который задает всю конфигурацию для FPGA. Потом вновь образовался полугодовой перерыв (ездил в командировку на Байкал, готовил в лаборатории установку, которую демонстрировали Путину). Но в конце концов звезды сошлись: у меня появилось время, приехали готовые платы – и я собрал свою систему.

Рис. 8. Создание «железа»

Подал все необходимые сигналы и – о, чудо! – увидел на осциллографе сигнал с чипа. (Осциллограф я купил когда-то за 6 000 рублей на eBay, еще 1 000 стоила прошивка к нему.) На картинке хорошо видны пятна – капельки какого-то реагента.

Рис. 9. Сигнал с чипа на осциллографе

Теперь мне нужно было придумать, как оцифровать эту картинку и передать ее на компьютер. Я собрал вот такую установку:

Рис.10. Схема прибора

Рис. 11. Готовая установка

Есть компьютер, который подает данные управления на плату с FPGA. Плата генерирует цифровые сигналы и отправляет их на чип. Сигнал с чипа идет на усилитель, далее – на АЦП на плате, оцифровывается и передается через COM-порт на компьютер. Вообще, пропускная способность COM-порта невелика: 15 килобит в секунду (т. к. в одном чипе находится от 1 млн до 10 млн «пикселей», а максимальная скорость передачи – 115200 бод). Тем не менее картинка на компьютер в итоге попадает.

Рис. 12. Обработанный сигнал на компьютере.

На фото выше видно, что, когда на использованный б/у-шный чип подается библиотека ДНК, чип заполняется неравномерно: по краям – в меньшей степени. Разные цвета обусловлены разным напряжением на pH-транзисторах. То есть мы можем ясно различить те лунки, куда попали сферы с ридами – впоследствии это поможет нам контролировать промывку чипа.

Соответственно, следующей задачей стала промывка чипа. Нужно было добиться, чтобы он стал, как новый. К счастью, у меня имелся совершенно новый чип в качестве референсного образца. На илл. А видно, что в активной области такой чип практически одного цвета (вертикальные повторяющиеся полосы – это просто шумы, наводки).

Рис. 13. Промывка чипа

На рис. 13 B неудачно промытый чип – он разноцветный. На рис.13 D – использованный, но хорошо промытый чип. Видно, что градиент по краям исчез. Тем не менее стоило бы еще доказать, что он действительно чистый и может использоваться повторно.

Поскольку библиотеки ДНК прикрепляются к танталовому покрытию чипа в кислой среде и открепляются – в щелочной (то есть при высоком pH), то чип промывается с помощью специальных полуавтоматических пипеток растворами с разными pH. На сегодняшний день мне удалось добиться практически полной очистки чипа.

У меня интересовались, почему, когда я полностью разобрался в структуре чипа, я не стал заказывать его изготовление, а предпочел по-прежнему искать и доставать б/у-шные, возиться с их промывкой и т. п. Да потому, что разработка микросхемы стоит огромных денег, миллионы долларов, и солидная часть этой суммы уходит на физическую отладку полученного продукта: подгонку, настройку всех параметров транзисторов и т. д. То есть просто скопировать логическую схему – недостаточно. Поэтому я беру условно бесплатную, уже готовую – спроектированную, изготовленную, отлаженную – микросхему и таким образом экономлю значительные средства, серьезно удешевляю проект.

Следующей моей задачей было собрать более продвинутый прибор, который позволял бы быстрее передавать информацию на компьютер и при этом не состоял бы из огромного количества отдельных плат.

Рис.14 Разработка следующей версии прибора

Я взял новую плату с FPGA – на том же кристалле здесь было 2 ARM-ядра с Linux, имелся Gigabit Ethernet и прочие «плюшки», но зато, в отличие от предыдущего варианта, не было АЦП. Позже спроектировал еще одну плату, с высокоскоростными АЦП и всеми другими необходимыми элементами. Запустил – все заработало.

Что осталось сделать для появления финального прибора? Всего три вещи.

Первое. Нужен гигабитный интернет, быстрая передача данных на компьютер. Это я реализовал буквально вчера.

Второе. Система подачи реагентов. Проектирование специального клапана уже в процессе.

Третье. Софт для обработки информации с чипа. С ПО пока есть вопросы, поэтому приглашаю к сотрудничеству программистов.

Финальный прибор стоит 10 млн рублей. Себестоимость секвенирования составляет несколько тысяч долларов. Чипы обходятся от 100 до 1000 долларов – в зависимости от количества «пикселей» в них. (К слову, восстановление чипов само по себе может стать неплохим заработком, особенно учитывая, что для промывки нужно сделать лишь пару кликов.) Реагенты тоже покупаются, но в перспективе будут создаваться и они.

В общем все это очень интересно, но главное – за этим будущее. Сегодня биотехнологии занимают в мировом научно-техническом прогрессе то же место, что компьютерные технологии в 80-х гг. прошлого века. При этом секвенирование – одно из ключевых направлений для современной биологии и медицины. Ну и, конечно, биотехнологии – это очень прибыльно.

В последнее время на рынке появился полупроводниковый секвенатор S5, и в ближайшее будущие я планирую переключиться на него.

Буду рад пообщаться со всеми, кто захочет тем или иным образом поучаствовать в развитии этого проекта!
Проект был бы не возможен, без теоретической подготовки

Сложить журавлика из бумаги — легко! Сложить журавлика из молекулы ДНК... тоже легко! Немного усидчивости и мастерства позволяют своими руками создавать из бумаги настоящие произведения искусства. Молекулы ДНК, в свою очередь, не требуют специальных навыков и собираются в красивые структуры на подобие оригами легко и непринужденно! Звучит как бред сумасшедшего, скажете вы. Отнюдь! Из этой статьи вы узнаете, как создать свою собственную фигурку оригами из ДНК, как похитить золото с помощью роботов, и кто победит в схватке между тараканом и ДНК-машиной.

Эта работа публикуется в рамках конкурса научно-популярных статей, проведенного на конференции «Биология - наука 21 века » в 2014 году.

ДНК-оригами и связанные с этим ДНК-нанотехнологии сформировали в последнее десятилетие отдельное научное направление и получили стремительное развитие в работах нескольких научных групп по всему миру. В общем случае, за термином «ДНК-оригами» скрывается технология направленного конструировании молекул ДНК, способных к самосборке в заранее рассчитанные и смоделированные объекты. Такие конструкции могут быть как плоскими, так и объемными, довольно простыми и чрезвычайно замысловатыми. Все так же, как в японском искусстве складывания бумажного листа, только здесь вместо листа бумаги выступает нить ДНК!

Как и многие научные открытия и разработки, это направление возникло, в некоторым смысле, случайно и неожиданно. Впервые о конструировании и использовании 3D-структур из ДНК всерьез заговорил американский ученый Нэд Симан (Ned Seeman ) в начале 1980-х гг. Исследователь указывал на одну из главных сложностей метода рентгеновской кристаллографии (используемого тогда и по сей день для определения структуры белковых молекул), а именно необходимость подбора точных условий для получения «чистого» кристалла, по которым можно судить о структуре белка, и ставил своей целью разработку вспомогательной технологии фиксации белковых образцов (рис. 1). Для решения поставленных задач нужно было для начала разобраться с тем, как по собственному желанию и разумению собирать молекулы ДНК в необходимые конструкции.

Рисунок 1. А. Гравюра на дереве «Глубина», созданная Маурицем Корнелисом Эшером в 1955 году. Поговаривают, что, глядя на это произведение искусства в университетской столовой, Нэд Симан вдохновился на создание новой технологии, упрощающей кристаллизацию полипептидов и, следовательно, структурные исследования белков. С определением пространственной организации белков что-то не заладилось, но зато идеи Симана были подхвачены другими исследователями и привели к возникновению ДНК-оригами . Б. Схема процесса кристаллизации белков, нарисованная В. Идея ДНК-структур для правильной ориентации молекул в пространстве, изображенная Симаном (перевод автора статьи).

Поиск и описание различных свойств элементарных ДНК-конструктов длились несколько лет. В 1991 году Нэд Симан представил нанометровый куб, ребра которого представляли собой молекулы ДНК . Спустя некоторое время, несмотря на скептическое отношение некоторых ученых, работа была признана выдающейся. За неё Нэд Симан был удостоен Фейнмановской премии по нанотехнологиям в 1995 году и навсегда вошел в историю науки как создатель первых ДНК-нанотехнологий.

Результаты Нэда Симана и его лаборатории послужили фундаментом для идей другого блистательного исследователя и, без преувеличения, крупной фигуры в области ДНК-оригами - американца Пола Ротемунда. В 2006 году он опубликовал статью в авторитетнейшем научном издании Nature , в которой был описан метод получения точных ДНК-структур с заданной формой, а также были представлены детальные результаты и анализ такого направленного конструирования. В отличие от других исследователей, ему удалось строить не решетки из отдельных молекул, а настоящие плоские фигуры шириной в несколько цепочек ДНК (рис. 2). Эта статья сразу разлетелась по научно-популярным журналам, новостям и блогам, ведь представленные структуры и изображения впечатляли даже неподготовленного с научной точки зрения читателя. Не удивительно, что иллюстрации эксперимента красовались на обложке выпуска журнала.

Рисунок 2. Некоторые структуры, построенные при помощи ДНК-оригами и представленные в статье Пола Ротемунда .

В последующие годы вышло несколько десятков статей, посвященных технологии ДНК-оригами. Росло число полученных форм, размеров конструкций и их сложности. Некоторые из результатов были экспериментально опробованы на реальных биологических объектах для решения прикладных биотехнологических и медицинских задач.

Двумерное ДНК-оригами: от простого к сложному

Как же ученые складывают ДНК-оригами? Разберемся в деталях данного метода. Для начала нам потребуется длинная одноцепочечная молекула ДНК, которая будет играть роль каркаса и основы нашего будущего объекта. В первых экспериментах использовалась ДНК фага M13 длиной 7249 нуклеотидов, однако сейчас с усовершенствованием ряда технологий стали использовать другие последовательности ДНК. Затем нам понадобятся заранее синтезированные короткие комплементарные цепочки ДНК (также называемые «скрепляющими цепочками» или «ДНК-скрепками», обычно 30-40 нуклеотидов в длину), последовательность которых необходимо подобрать при помощи компьютерного моделирования и анализа структур. Теперь смешаем растворы с длинной молекулой и короткими «скрепками» и нагреем смесь до температуры 95 °C, чтобы случайные и ненужные молекулярные связи распались. В процессе остывания до комнатной температуры (эта процедура называется отжигом) молекулы ДНК сами соберутся вместе, образуя нужную нам структуру. Проще простого - они всё делают за нас сами!

Рисунок 3. А, Б иллюстрируют схему связей между каркасной ДНК (серая кривая) и скрепляющими олигонуклеотидами (кривые разных цветов) . В) Пошаговая схема по изготовлению ДНК-оригами .

В результате эксперимента получается раствор, содержащий желаемые ДНК-конструкции. В одной-единственной капле раствора скрываются миллиарды крошечных объектов, которые, в отличие от бумажных фигурок оригами, нельзя потрогать, повертеть в руках и рассмотреть. Для оценки результата нам потребуется прибор со сверхвысоким разрешением - атомно-силовой микроскоп (АСМ) или электронный микроскоп. Ведь рассмотреть фигурки размером 50-100 нм так непросто!

Для создания плоских структур ДНК-оригами смежные двухцепочечные молекулы должны быть соединены друг с другом кроссовером - особым типом переплетения нитей ДНК. Такое переплетение «склеивает» соседние цепочки посредством уотсон-криковского комплементарного спаривания и не дает всей структуре рассыпаться. Учитывая большое количество скрепляющих цепочек, требуются алгоритмы для расчета вероятности их точной посадки на основную цепь. Если ДНК-скрепка сядет не в том месте, то это может повлечь за собой как дефект структуры, так и полную путаницу в посадке всех остальных скрепок. В худшем случае это может привести к тому, что структура не соберется вовсе. Все-таки самосборка молекул в идеально плоскую структуру - это не такая уж и легкая задача.

Рисунок 4. Точность собранного рисунка может быть довольно высока и находиться буквально на грани разрешения современных приборов. Можно добиться того, чтобы на ровном плоском «ДНК-полотне» в заранее предусмотренных местах будут выбиваться ДНК-шпильки. Это выглядит так, как если бы на кусочке ткани сделали рисунок узелками. Именно так была собрана карта западного полушария Земли, которую можно было увидеть исключительно при помощи АСМ (а, б).

Двумерные структуры на основе ДНК-оригами позволяют достичь не только большого многообразия форм - с помощью этой техники можно добиться невиданной до этого точности в размещении требуемых функциональных групп и молекул. Связанные с ДНК-скрепками молекулы могут быть размещены с точностью до нескольких нанометров и даже ангстрем (при условии правильной сборки)!

Если требуется собрать структуру побольше, нужно всего лишь соединить несколько длинных цепочек в одну составную конструкцию, как в конструкторе или крупных оригами-фигурах. На практике это можно осуществить так же, как было описано для одной единственной каркасной молекулы ДНК - нужно смешать все ингредиенты будущего объекта в одной пробирке, нагреть и ждать чуда, или собрать каждую деталь по отдельности, после чего объединить уже готовые элементы для окончательной сборки при менее интенсивном нагреве. В первом подходе нам приходится работать с достаточно большим количеством компонентов, ввиду чего увеличивается вероятность неправильной сборки молекул. При сборке деталей по отдельности необходимо провести несколько независимых экспериментов и совершить дополнительный шаг - повторный отжиг малых структур при нагреве до температуры 50 °C. При такой температуре детали еще не разваливаются на части, но уже более охотно связываются с друг с другом [ , ].

Трехмерное ДНК-оригами

При определенных модификациях подход, который применяется для конструирования плоских структур, может быть обобщен до более сложного объемного случая. При конструировании 3D-структур можно, как и раньше, использовать кроссоверы, учитывая дополнительное третье измерение, и собирать все за один эксперимент, либо нужно начинать с собранных по отдельности плоских ДНК-объектов и лишь потом объединять их в конечную конструкцию. Выбор правильной последовательности действий в случае трехмерного ДНК-оригами чрезвычайно важен из-за значительно большего числа используемых молекул. Для особо сложных конструкций (особенно, при выборе первой стратегии сборки за один эксперимент) самосборка объекта может занимать несколько дней.

Несмотря на все сложности, которые могут возникнуть, объемные конструкции так привлекательны для исследователей! Ведь объемные объекты, ввиду многообразия возможных форм, могут быть использованы в широком круге самых разных прикладных задач.

Рисунок 5. ДНК-«коробочка» с открывающейся крышкой и молекулярным «замком». Получена в Датском центре ДНК-нанотехнологий в 2009 году. Предполагается, что в будущем такая конструкция будет использоваться для адресной доставки лекарств к определенным клеткам, где она будет открыта при помощи молекулярного «ключа».

Так, используя несколько одинаковых квадратов, ученым удалось собрать полый куб (правда, немного деформированный). Для устранения недостатков конструкции исследователи приделали к этому кубу крышку, которая запиралась на замок нанометровых размеров. Открытием крышки можно было управлять при помощи изменения конформации замка за счет спаривания с небольшими «ДНК-ключами» (рис. 5). Убедиться в том, что куб надежно закрывается на замок и открывается лишь определенным ключом, помог эффект FRET . При этом данная конструкция стала одним из первых в своем роде контейнером для адресной доставки лекарств. Пока только в перспективе, конечно же.

Следующим этапом конструирования 3D объектов стала сборка строительных блоков, которые в дальнейшем скреплялись между собой, как детали конструктора (подробнее об этом можно прочесть в ).

Словарик

Применение ДНК-оригами: ДНК-чипы, молекулярные машины и нанороботы

Пока мы затрагивали в основном процесс конструирования и сборки ДНК-оригами, и практически никак не упоминали о том, зачем все это нужно. И действительно, ведь ДНК-структуры разрабатываются не для того чтобы ими любоваться и получать эстетическое удовольствие! Современные ДНК-нанотехнологии направлены на решение нескольких прикладных задач, связанных с медициной, биотехнологией и программированием.

ДНК-конструкции могут нести на поверхности несколько строго ориентированных функциональных групп, специфически связывающих ту или иную молекулу, и, таким образом, регистрировать их присутствие. В самых простых случаях синтезируется специальная ДНК-скрепка с последовательностью, комплементарной молекуле РНК или ДНК в растворе. При использовании АСМ мы можем зафиксировать даже акт единичного связывания такой молекулы, так как при возникновении связи между структурой ДНК-оригами и целевой молекулой, последняя начинает сильно «выпирать» . Это сразу бросается в глаза при анализе изображения.

Использование лигандов или аптамеров позволяет создавать настоящие сенсорные чипы. С их помощью можно регистрировать наличие не только одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот, но и интересующих нас молекул белков и других соединений. При удачном стечении обстоятельств, речь может идти об обнаружении даже единичных молекул.

Способность к регистрации можно улучшить, фиксируя структуры ДНК-оригами на поверхности подложки. Подложка при этом заранее размечается методами литографии и травления, после чего обрабатывается специальными химическими соединениями. При правильной подготовке «плацдарма» для посадки, ДНК-структуры выстраиваются точно по порядку в интересующих нас местах и даже в нужной ориентации . В совокупности, последовательность таких операций дает довольно точное размещение на подложке конструкций ДНК-оригами, которые, в свою очередь, служат подложкой для еще более точного размещения исследуемых молекул самой разной природы. Чип для широкого круга регистрируемых химических соединений готов к использованию!

Одним из интереснейших направлений ДНК-нанотехнологий является создание молекулярных машин, которые могли бы проводить разнообразные операции при минимальном участии человека. Например, Нэд Симан с коллегами собрал шагающую ДНК-машину с двумя ногами . На заранее сконструированной подложке (тоже собранной из ДНК) они разместили несколько других простых ДНК-машин, которые держали золотые наночастицы и могли их высвобождать при изменении конформации. Наш «молекулярный пешеход» ходил по подложке (по заранее известной дороге, которую тоже надо было собрать) и, когда оказывался вблизи носителей золота, отбирал у них золотую наночастицу! Заполучив немного золота, наш герой не успокаивался и шел за следующей порцией золотой добычи. По окончанию экспериментов жадный ДНК-пешеход должен был неплохо обогатиться!

Для того, чтобы продемонстрировать возможности программируемого перемещения молекулярных машин, другая группа исследователей собрала ДНК-«паука» с тремя ногами и одним хвостом . (Странный, конечно, паук получился, но мы закроем на это глаза.) К ногам ДНК-«паука» были прикреплены функциональные молекулярные группы, которые позволяли перемещаться по специально созданной для этого трассе. Паук был привязан молекулой-замком за хвост в самом начале своего пути; затем, после связывания молекулы-замка с молекулой-ключом, его отпускали на свободу, и он убегал исследовать мир! Передвижение ДНК-паука было заснято в реальном времени при помощи микроскопии полного внутреннего отражения - его средняя скорость составила 3 нм/мин. Видимо, он не убегал, а скорее с наслаждением прогуливался по своей дорожке.

Большие надежды возлагаются на ДНК-оригами и другие ДНК-нанотехнологии в связи с вопросом адресной доставки лекарственных средств нуждающимся клеткам. К сожалению, это направление не проработано так хорошо, как другие, и всё ещё находится на стадии интенсивных исследований. Остается верить, что открытия, связанные с ДНК-роботами, служащими на благо здравоохранения и человечества в целом, ещё впереди!

Вместо заключения

К настоящему моменту учеными из разных стран собран большой объем экспериментальных данных и описано большое число механизмов на основе ДНК-технологий, которые ещё только предстоит полностью осмыслить и оценить. Уже сейчас подробно описать каждую из полученных структур и её преимущества над другими не представляется возможным. Ведь если только 10 лет назад исследованиями такого рода занималось всего несколько лабораторий во всем мире, сейчас их количество исчисляется несколькими десятками. Относительно будущего данной области науки сказать определенно можно только одно - дальше будет еще интереснее! Чтобы убедить вас в этом, приведем заголовок статьи, которая вышла в апреле 2014 года - «Universal computing by DNA origami robots in a living animal», в которой описано использование ДНК-нанороботов в живых тараканах Programmed two-dimensional self-assembly of multiple DNA origami jigsaw pieces . ACS Nano 5, 665-671; ;